帕金森病嚙齒類動物模型的制備方法

一、通過耗竭單胺類神經(jīng)遞質(zhì)制作PD模型

(一)利血平模型

利血平是一種生物堿。通過不可逆地封閉囊內(nèi)單胺運(yùn)輸消耗中樞和外周單胺，從而影響細(xì)胞內(nèi)囊泡的單胺再循環(huán)，于20世紀(jì)50年代被用于制作大鼠PD模型。當(dāng)嚙齒類動物注射利血平后，囊內(nèi)攝取的DA、5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素(NA)被封閉，在胞質(zhì)內(nèi)被降解，快速降低單胺水平，導(dǎo)致肌肉僵硬等PD的癥狀。

制備方法：應(yīng)用雄性Wistar大鼠，腹腔內(nèi)注射一定劑量的利血平后即可使其出現(xiàn)骨骼肌僵硬、震顫、姿勢異常。該模型制作方法簡單。其對人類大的貢獻(xiàn)在于揭示出左旋多巴(L-DOPA)可作為治療PD的潛在藥物。缺點(diǎn)是只能短暫模擬PD的癥狀，不能*復(fù)制自發(fā)性PD的病理變化。

(二)甲丨基丨苯丨丙丨胺模型

苯丨丙丨胺丨類藥物是一類具有潛在成癮性的神經(jīng)興丨奮丨劑，具有促DA釋放作用，大劑量應(yīng)用對嚙齒類動物和非人類的靈長類動物具有神經(jīng)毒性，像利血平一樣，它能夠?qū)е翫A能神經(jīng)元末梢DA的耗竭，對黑質(zhì)神經(jīng)元損傷作用較小。Boirean等研究表明，該藥可通過DA轉(zhuǎn)運(yùn)體被攝入細(xì)胞內(nèi)，興奮性氨基酸受體拮抗劑MK.801可阻斷其毒性作用，體外實(shí)驗(yàn)提示能量代謝障礙、氧化應(yīng)激和興奮性氨基酸均與其毒性作用有關(guān)。制作方法：用成年大鼠，按體重10～25mg/kg皮下注射甲丨基丨苯丨丙丨胺，每天一次，連續(xù)4天。用藥后可出現(xiàn)短暫活動過多，隨之是活動減少。4～5d后可有“幻覺樣"行為，表現(xiàn)為顫抖、舔毛、咬皮毛。1周后檢測即可發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)和紋狀體中酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)活性降低，DA含量減少，但黑質(zhì) DA能神經(jīng)元丟失不明顯。該模型制作方法簡單，是一個急性損傷模型，癥狀的持續(xù)時間及穩(wěn)定性方面尚不理想，也無PD的特征性組織病理學(xué)改變。主要用于研究PD多巴胺耗竭后的紋狀體生理、生化學(xué)改變，也可用于神經(jīng)保護(hù)方面的研究。

二、神經(jīng)毒素制作PD模型

對PD患者大腦的研究顯示，在氧化應(yīng)激過程中存在線粒體復(fù)合物Ⅰ功能的抑制，因而這可能是黑質(zhì)DA神經(jīng)退行性變的重要組成部分。對MPTP、6-羥基多巴胺(6-OHDA)和羅藤酮的研究已經(jīng)為探索多巴胺神經(jīng)元死亡的分子機(jī)制提供了希望。

MPTP是1982年在一組藥物成癮所致的亞急性重癥帕金森病患者體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。這種癥狀是由于這些人自己服用一些含有與人工合成的ma啡結(jié)構(gòu)相似的藥物所致。而這種藥物被加工過程中的一些副產(chǎn)物MPTP所污染，這種副產(chǎn)物有高親脂性并且能夠通過血腦屏障。膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的單胺氧化酶能將MPTP轉(zhuǎn)化成1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)，后者可以被DA轉(zhuǎn)運(yùn)體所攝取并在DA神經(jīng)元內(nèi)堆積。缺乏這種轉(zhuǎn)運(yùn)體的小鼠能避免MPTP的毒性損害。吸收的MPP+在線粒體內(nèi)富集，它們能夠抑制線粒體電子傳遞鏈中復(fù)合物Ⅰ的功能，從而使 ATP的生成減少并且產(chǎn)生活性氧自由基誘導(dǎo)DA神經(jīng)元的凋亡。有趣的是，MPTP甚至能使具有zhong央神經(jīng)系統(tǒng)的一些低級的無脊椎動物如扁形蟲、三渦蟲神經(jīng)元死亡。這提示 MPTP對無脊椎動物和靈長類動物都具有神經(jīng)毒性。故在靈長類動物，如人、猴、狒狒中， MPTP能引起不可逆的嚴(yán)重的帕金森病癥狀，這種癥狀與散發(fā)的PD不能區(qū)別。這其中包括黑質(zhì)DA神經(jīng)元的變性，微包涵體的出現(xiàn)[如嗜伊紅性包涵體和α-synuclein的聚合體(并不是典型的Lewy體)]，在電鏡下觀察，這些微包涵體由一個高密度的粒狀核心和圍繞其周圍的放射狀細(xì)絲暈組成。對靈長類動物予以MPTP處理后其顯示出對左旋多巴(L-3，4二羥基多巴)及其他DA受體激動劑較好的應(yīng)答。然而，采用MPTP毒素制作PD模型的主要缺點(diǎn)是PD是一種慢性發(fā)展的疾病，而MPTP所致的是急性或亞急性的發(fā)病過程。在靈長類動物中采用不同的劑量水平慢性給予MPTP已經(jīng)顯示能夠產(chǎn)生緩慢發(fā)展的帕金森病癥狀，在紋狀體中多巴胺纖維的損失不均勻，并且顯示出在黑質(zhì)部位DA神經(jīng)元的選擇性損耗。

6-OHDA是用來制作帕金森病動物模型的另一種藥物。常用的方法是單側(cè)注射6- OHDA至黑質(zhì)或者zhong央前腦束，這可以使DA神經(jīng)元細(xì)胞在較短的時間內(nèi)快速死亡。這與急性MPTP模型相似。另外一種6-OHDA模型直接注射這種毒素到紋狀體內(nèi)而導(dǎo)致黑質(zhì)神經(jīng)元的退行性變。這種方法可以在4周內(nèi)緩慢地?fù)p傷部分神經(jīng)元，因而已經(jīng)被用來模擬PD的慢性病程。

在向黑質(zhì)注射6-OHDA之后，這些藥物選擇性地積聚在DA神經(jīng)元，并對其產(chǎn)生毒性作用。這一過程可能是通過產(chǎn)生自由基而完成的。6-OHDA對大鼠、小鼠、貓及靈長類動物是一種的毒物，并且被廣泛用來制作單側(cè)損傷模型。在大鼠中廣泛的DA損耗可以通過對給予安丨非丨他丨明和脫水ma啡引起的旋轉(zhuǎn)活動來進(jìn)行評估。這種模型主要的優(yōu)點(diǎn)是可以計量運(yùn)動減少(旋轉(zhuǎn))，因而這一模型被證實(shí)在藥理學(xué)研究中用來觀察藥物對多巴胺及其受體是否有效是非常有用的。

羅藤酮是一種天然的殺蟲劑，其起源于某些特殊植物的根部，并且是一種線粒體復(fù)合物Ⅰ的高親和力特異性抑制劑。Betarbet等證實(shí)大鼠通過頸靜脈叢插管、系統(tǒng)地給予羅藤酮可以產(chǎn)生許多PD的特征，包括黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的變性和DA神經(jīng)元內(nèi) Lewy體的形成。這些包涵體可以被泛肽和α-synuclein抗體所染色，電鏡下觀察，高密度的核心被纖維狀物質(zhì)環(huán)繞，這與Lewy體的結(jié)構(gòu)非常相似。實(shí)驗(yàn)大鼠出現(xiàn)運(yùn)動徐緩、姿態(tài)不穩(wěn)、步態(tài)不穩(wěn)及一些震顫的跡象，這些癥狀在給予DA受體激動劑脫水ma啡后得以改善，提示這種緩慢的羅藤酮給藥法是一個較好的改進(jìn)的簡單給藥法。

在大鼠黑質(zhì)內(nèi)單獨(dú)注射MPP+、6-OHDA和羅藤酮引起不同的運(yùn)動功能抑制。MPP+、6-OHDA和羅藤酮是多巴胺能的神經(jīng)毒素，但是這些毒素對大鼠腦組織毒性作用的機(jī)制仍然不是很清楚，需要進(jìn)一步深入研究。