蛋白質(zhì)N-糖基化修飾及其研究的意義

蛋白質(zhì) N-糖基化修飾在生物體中非常重要，蛋白質(zhì)N-糖基化修飾影響蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定性、細胞定位、受體-配體相互作用等。它的研究也一直是蛋白質(zhì)組學、細胞生物學與疾病機制研究的熱點。N-糖基化研究能解釋“為什么同一個蛋白在不同情況下功能不同"： 同一種蛋白，即使氨基酸序列相同，N-糖基化位點的占據(jù)率與糖型組成仍會隨細胞狀態(tài)變化而變化。蛋白質(zhì)N-糖基化修飾對疾病機制與生物標志物開發(fā)尤為關鍵：N-糖基化與多種疾病密切相關：

? 癌癥：腫瘤常伴隨糖基化加工失衡，出現(xiàn)糖型重塑，影響腫瘤生長、侵襲、免疫逃逸。

? 免疫疾?。禾切透淖儠绊懨庖呒毎荏w功能與免疫識別。

? 遺傳與罕見?。禾腔访富蜣D(zhuǎn)運相關基因異常會導致廣泛的蛋白錯誤折疊與功能缺陷。

? 感染與炎癥：病原體與宿主之間的糖識別、炎癥信號都可能涉及 N-糖基化變化。

如何進行蛋白質(zhì)N-糖基化修飾研究

蛋白質(zhì) N-糖基化（N-glycosylation） 的研究通常要覆蓋：位點鑒定→ 糖型（結(jié)構(gòu)）分析 → 蛋白表達（折疊/表達/定位/穩(wěn)定性等）→ 功能或通路驗證。目前常用的驗證策略如下

1) 設計突變

對目標位點的 Asn進行突變，做至少三組：WT（野生型）、單突變（每個位點各自）、多位點突變/組合突變（如果多個位點貢獻疊加）。

2) N-糖基化對蛋白質(zhì)表達的影響

n 表達量（Western/ELISA/流式）

n 蛋白穩(wěn)定性（Cycloheximide追蹤或蛋白半衰期）

n 亞細胞定位（免疫熒光/流式表面染色/分級提?。?/p>

n 整體折疊狀態(tài)（必要時做構(gòu)象抗體或SEC/DSF）

3) 根據(jù)你的蛋白功能選擇合適功能實驗，例如：

n 酶活（底物底物法）

n 受體/配體結(jié)合（SPR/BLI/共沉淀）

n 信號通路激活（報告基因 ）

n 運輸/分泌（分泌量、細胞表面水平）

n 細胞表型（增殖、遷移、凋亡等；最好回到分子層面）

4) 抑制糖基化或者類型

n 抑制糖鏈合成/轉(zhuǎn)移：使 N-糖基化整體減少或改變

n 抑制特定糖基化酶：例如巖藻糖轉(zhuǎn)移酶等

n 抑制加工（ER→Golgi）：改變糖型成熟度

案例分享——PD-1

1. PD-1是高度糖基化修飾的蛋白質(zhì)

PD-1（Programmed cell death-1，程序性死亡受體1）是腫瘤免疫治療中最核心的免疫檢查點之一。PD-1是一種表達在免疫細胞表面的抑制性免疫檢查點受體。它的主要作用是幫助機體在免疫反應過強時“剎車"，維持免疫穩(wěn)態(tài)；但在腫瘤中，PD-1 通路會被利用來讓腫瘤逃避免疫清除。研究發(fā)現(xiàn)，PD-1 在 N49、N58、N74 和 N116 位置發(fā)生 N-連接糖基化，這一過程由糖基轉(zhuǎn)移酶 B3GNT2 促進。此外，PD-1 的核心巖藻糖糖基化發(fā)生在 N49 和 N74 位點，由核心巖藻糖糖基轉(zhuǎn)移酶 FUT8 介導。此外，PD-1 在 T153、S157、S159 和 T168 位點發(fā)生 O-連接糖基化。

圖1 PD-1 的糖基化和巖藻糖化調(diào)控的示意圖

2. N-糖基化修飾對PD-1的影響研究案例

盡管使用單克隆抗體進行PD-1 阻斷治療在臨床上取得了成功，但大多數(shù)患者對這種治療沒有反應，而PD-1 的潛在調(diào)節(jié)機制仍未wan全明確。

作者通過突變、功能實驗等，表明 PD-1在T細胞中廣泛進行N-糖基化，并且其特定糖型的強度在TCR 激活后會發(fā)生變化；糖基化對于維持 PD-1 蛋白的穩(wěn)定性和細胞表面定位至關重要；PD-1的糖基化，尤其是 N58 位點的糖基化，對于介導其與 PD-L1的相互作用是bi不可少的。

此外作者基于目前PD-1靶向治療的局限性，設計單克隆抗體 STM418 特異性靶向糖基化的PD-1，其與PD-1 的結(jié)合親和力高于已獲批的PD-1抗體，能有效抑制PD-L1/PD-1結(jié)合，并增強抗腫瘤免疫反應。這些研究結(jié)果共同揭示了PD-1葡糖基化的功能意義，并為將葡糖基化的PD-1作為免疫治療潛在策略加以靶向提供了理論依據(jù)。文章整體設計及結(jié)果如下所示：

圖2 文章設計及結(jié)果總結(jié)